蛋白质三维结构与功能研究
1、梁栋材组
几种生物大分子的三维结构与功能研究
1、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶（GDPD）：
甘油磷酸二酯磷酸二酯酶（GDPD）催化甘油磷酸二酯，水解成一个醇类和一个三磷酸甘油。它的产物参与到很多的生化途径中，起到重要的作用。我们解析了来自于T. tengcongensis 的GDPD（ttGDPD）的1.9埃的结构。通过对保守残基的单点突变研究，i）我们首次确定了GDPD是一个金属依赖酶；ii）确定了ttGDPD的活性残基，并提出了ttGDPD的可能的催化机制；iii）根据同源蛋白1zcc的结构中活性位点结合的硫酸根离子，通过把它模拟成GDPD底物中的磷酸半族，分析了ttGDPD底物分子甘油磷酸二酯分子和ttGDPD的实际结合情况。（Proteins (2008) 72, 280-288)
2、类β-内酰氨酶折叠金属水解酶（metallo-β-lactamase）：
类β-内酰氨酶折叠金属水解酶家族成员数量众多，其结构和功能也有很大的差异。本研究中来源于T. tengcongensis的基因tte1889就是属于该家族的成员之一。我们运用SIRAS方法解析了tte1889编码蛋白在氧化状态下的2.1?的结构。结构分析表明，此蛋白在三维结构上拥有一个由4个反向β折叠组成的新的motif结构，在PDB库中没有发现其类似motif结构。我们通过晶体结构分析结合UV/vis光谱和EPR波谱，初步确定此蛋白在无氧还原条件下活性部位拥有一个杂合配位的[Fe-S]簇，这在金属β内酰氨酶超家族中是首次发现。（Proteins (2008) 72, 531-536）
3、甘露聚糖酶（BCman）
β—甘露聚糖酶水解β-甘露聚糖型植物胶(如角豆胶、瓜儿豆胶和魔芋等)生成的低聚寡糖具有增殖双岐杆菌，激活植物防御系统等生理功效。我们运用SIRAS方法获得了BCman晶体三维结构的解。1.45?的晶体结构分析表明，BCman浅碟型活性中心与其它内切β－甘露聚糖酶的马鞍型活性中心完全不同。ITC测定和三维结构分析结果揭示，在BCman浅碟型活性中心只有2个底物结合位点（＋1和－1）参与酶对糖链的有效降解，限制了BCman与甘露寡糖的结合。位于活性部位、暴露于溶剂区的芳香氨基酸形成了疏水接触面，并促进了酶对甘露聚糖的结合和催化（图）。（J. Mol. Biol. (2008) 379, 535–544）
4、磷酸甲羟戊酸激酶(Pmk)
催化ATP的γ磷酸转移到底物5-磷酸甲羟戊酸上生成5-二磷酸甲羟戊酸。该反应是依赖甲羟戊酸的类异戊二烯生物合成途径的限速步骤之一。本研究运用SAD方法解析了人源磷酸甲羟戊酸激酶的1.76 ?的晶体结构。通过对其三维结构和保守氨基酸残基的相关探讨，我们确定了一些与底物结合和催化相关的保守残基(图)，为揭示其可能的底物结合方式及相关的酶活催化机制提供了可靠的结构基础。（Proteins (2008) 73, 254-258）
2、饶子和组
本组研究重点在以下三个方面：“高致病性传染病病原体重要蛋白质结构与功能的研究”、“中药等天然产物混合体系中进行创新药物开发的平台的建立和完善”和“与人类疾病相关的其他重要靶标蛋白质的结构与功能的研究”。本年度研究成果在Nature、J Virol.等国际专业研究期刊上发表研究论文24篇，获授权国家发明专利5项，不仅为揭示重大疾病的发生与防治的机理提供了重要的结构生物学基础，也为从中药等天然产物中开发创新药物奠定了理论和实验基础。
冠状病毒非结构蛋白的结构与功能研究及抑制剂的研究 在SARS冠状病毒转录与复制过程中检验点的研究有了新的突破，解析了作为引物酶的nsp8蛋白的第III种构象及其与GTP结合的复合物晶体结构，为阐明冠状病毒基因组转录复制机制的时间细节及分子机制奠定了基础；完成了SARS冠状病毒主蛋白酶H41A突变体与抑制剂复合物、人源HKU1主蛋白酶及其抑制剂复合物以及IBV主蛋白酶及其与N3抑制剂复合物的晶体结构的解析，为针对于冠状病毒主蛋白酶的广谱抑制剂的设计与研发建立了真实可信的结构模型；此外，我们还解析了MHV-A59和IBV nsp4 C端细胞内亲水结构域的三维结构、人源HCoV-229E及IBV的nsp3 ADRP结构域与其底物ADP-ribose复合物等一系列冠状病毒非结构蛋白的晶体结构，该研究成果对揭示SARS冠状病毒转录复制机制具有十分重要意义。
禽流感病毒RNA聚合酶结构解析 与刘迎芳研究组合作，在这一领域取得突破性进展，在国际上率先揭示了禽流感病毒（H5N1/Guangdong/1/96）聚合酶关键部分PA亚基C端结构域与PB1多肽复合体的精细三维结构。研究成果发表在Nature上。该复合体结构的解析，对揭示禽流感病毒聚合酶作用机制以及开展针对流感病毒药物设计工作具有十分重要意义。近期，我们又解析出禽流感病毒（H5N1/Guangdong/1/96）聚合酶功能部分PA亚基N端结构域，研究成果目前已被Nature正式接收。
PAC:PB1N复合体的三维结构高通量分子药物筛选平台的初步建立与成果 初步建立了一个以蛋白质结构为基础的“高通量分子药物筛选平台”，包括四个模块：靶标蛋白质库、中药等天然产物混合物药物筛选备选库、高通量分子药物筛选体系和先导化合物验证与优化体系。现已经开展了从天然药物库中筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂、HIV病毒蛋白酶抑制剂以及CDK2的药物筛选与设计等方面的工作并取得一定进展。
与人类疾病相关的重要蛋白质结构与功能的研究 解析了 BTG2/TIS21、人源LanCL1、人源Gadd45γ、钙调控热稳定蛋白CRHSP-24以及热休克转录因子结合蛋白HSBP1等一些与人类疾病相关蛋白质的晶体结构。
3、常文瑞组
2008年度，在研究所的大力支持与帮助下，我们建立了植物温室，并成功地种植了野生型拟南芥及其多种突变株。并已从其中一种突变株的叶片中提取到两种不同的光系统II中的光合膜蛋白复合物样品，样品的光谱性质均表现良好。通过对这两种样品进行晶体生长条件的大量搜索，目前均已获得微晶。现在正在对样品提取步骤进行优化，以期得到大量高质量的样品，来进行晶体生长。
本年度我们对已经得到的另外两种来源于菠菜的光合膜蛋白复合物样品的分离纯化条件做了进一步的优化，并制备了大量的样品。这两种光合膜蛋白复合物之前已经得到微晶，本年度我们又对这些样品的晶体生长条件进行了大量的优化，通过对各种参数的调整，这两种样品均得到了外形良好的单晶，我们对这些晶体进行了衍射实验，结果表明，其中1种晶体已达到中分辨率水平，但另1种晶体的分辨率低于10?。
此外我们与意大利Verona大学Bassi教授合作展开体外重组Lhc不同组份及其复合体的三维结构和功能研究，之前已成功获得两种稳定的重组Lhc样品，并获得其中一种样品的微晶。本年度经过大量的优化，该种样品已获得外形良好的单晶，但衍射实验表明该晶体的衍射能力极弱。
在其他一些有重要功能的可溶蛋白的三维结构研究中，本年度我们成功解析了硫氧化还原酶 (SOR)的两种不同晶型的晶体结构，并对该酶的催化机制及催化过程进行了讨论（Biochem. Biophys. Res. Commun.）。另外我们获得了人源DPY-30 的晶体，并收集到一套可用数据，现在正在进行重原子衍生物的制备工作。此外，我们开展了丁香假单胞杆菌的结构基因组研究，现已成功得到数种蛋白样品，其中一种样品已获得晶体。
4、王大成组
1、肿瘤相关蛋白质及复合物研究
在人泛素连接酶复合物研究中，获得Cul3-SPOP二元复合物的单晶体，Cul3-keap1-Neh2三元复合物的稳定重组蛋白及微晶。研究人细胞程序化死亡因子结构获得初步成果。测定人类细胞程序化死亡因子10（PDCD10）2.3埃分辨率晶体结构。PDCD10最早是在TF-1前骨髓瘤细胞的凋亡诱导实验中因为其表达水平显著上调而被观察到的。我国科学家在诱导纤维原细胞凋亡以鉴别特异的凋亡相关基因的研究中发现该基因的表达水平显著上调并且成功克隆了该基因。2005年的一项人类疾病的基因研究发现，PDCD10是一种叫做脑海绵状血管瘤（cerebral cavernous malformations，简称CCM）的第三种致病基因，该基因家族遗传性或偶发性的突变会导致CCM的发生。已解析的PDCD10晶体结构是一个具有全新类型的α螺旋分子，在PDB数据库中没有发现类似的结构。对这个结构及其与功能的关系的分析正在进行中。
2、病原菌致病相关蛋白质研究
以幽门螺旋杆菌四型分泌系统为中心，完成25个目标蛋白的基因克隆，获得5个纯化蛋白，3个蛋白质结晶，一个蛋白质结构解析。
幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）是慢性胃炎、胃十二指肠溃疡的重要致病因素，与胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤发生密切相关，世界卫生组织已将其列位一类致病因子。据统计，世界人群H. pylori感染率超过50%，而且目前临床上采用抗生素治疗H. pylori感染所面临多药耐药形势日趋严峻。但其致病机理尤其是在宿主中持续感染的机制仍不是很清楚，阐明其致病机理对有效预防和治疗H. pylori感染，具有重要意义。
测定幽门螺旋杆菌黏附定植相关蛋白HugZ及其配体复合物的三维结构及功能鉴定病原微生物的黏附定植是其感染致病的重要前提。而幽门螺杆菌在胃黏膜定植引起的持续性感染是导致胃肠道疾病的主要原因。研究表明，幽门螺杆菌的铁代谢相关蛋白在其黏附定植发挥着至关重要的作用，前期研究发现幽门螺杆菌未知功能蛋白HugZ与其适应性定植密切相关。我们在1.8?分辨率解析了HugZ及其与血红素结合的复合物HugZ-Hemin晶体结构，通过生物化学实验及微生物基因组学比较，推测HugZ为幽门螺杆菌铁代谢中关键的血红素氧合酶，并通过微生物生理研究确定了其氧合酶活性，鉴定其生物学功能。此外，在功能研究的基础上，在此基础上分析了HugZ的血红素结合表位及催化活性位点。
后续的酶学和结构生物学研究正在进行中，拟通过定点突变及基因敲除等手段构建突变株，以体外生物活性实验和动物实验验证其在幽门螺杆菌黏附定植中的作用，为进一步研究幽门螺杆菌的致病机制提供有力依据。
测定痢疾杆菌DNA拓扑异构酶（DNA gyrase）B亚基C端结构域（GgrB-CTD）的晶体结构，揭示其传递DNA T-segment的结构机理DNA gyrase是原核生物DNA拓扑异构酶，它催化DNA链的交换，调控DNA的拓扑结构，是维持细胞正常生存的重要分子，也是抗肿瘤和抗菌药物的重要靶标。Gyr是一个复杂的蛋白质分子机器，GryB-CTD是其中构成酶活性中心的重要组件。GyrB-CTD结构与张先恩研究组合作测定，首次揭示其类似水闸双门的特征二聚体结构，及可通过domain movement开/合，由此提出其传递DNAT-segment的结构机理。
3.芳香族化合物降解相关蛋白质：已建立11个蛋白组成的相关酶系列。
测定芳香族化合物生物降解途径中CubG酶分子的晶体结构CnbG是对氯硝基苯微生物降解途径中的一种酶，该酶催化2-氯-5-羟粘糠酸的酮化,研究的意义在于结合其它Cnb系列解决环境污染中日益增加的芳香族化合物的高效生物降解问题，提供一种微生物降解方案。目前已经解析CnbG 2.0埃的晶体结构，并正致力于分析其底物特异性和可能的催化机制， 以进一步了解酶形成新催化活性的方式和调控方式。
5、龚为民组
目前课题组的工作重点是真核生物蛋白质翻译起始因子和膜蛋白的结构与功能研究，建立了膜蛋白和蛋白质复合体的表达纯化系统，形成了相关功能研究的稳定合作伙伴。在真核翻译启始因子方面取得重要进展，克隆了人和酵母eIF2和eIF2B等启始因子，通过原核和真核表达系统，表达纯化了这些蛋白因子用于结构生物学和生物学功能等方面的相关研究。通过Se-Met置换，利用MAD法成功解析了人eIF2Bε亚基功能域的结构，同时构建了其相关的功能复合体来研究eIF2B催化eIF2所携带的GDP转化为GTP过程的分子机制。由于古细菌和真核生物的蛋白质翻译起始过程很相似，并且要简单的多，所以我们开始利用古细菌来研究从核糖体成熟向蛋白质翻译起始转移这一连续过程的分子机制。表达纯化了a/eIF2和核糖体30S亚基成熟因子复合体的核心因子aDim2p，构建了a/eIF2-aDim2p复合体，在对其进行晶体的筛选的同时，我们开始构建古细菌核糖体30S亚基-a/eIF2-aDim2p复合体用于进一步的分析研究。对膜蛋白的研究主要集中在两个方面：膜蛋白及其复合物的表达、纯化和结晶的研究以及膜运输过程中囊泡形成的分子机制的研究。在前期工作的基础上，今年我们从原核系统表达并纯化了一个跨膜蛋白，DAGK，并最终得到在生物物理所的室内光源可衍射到18?的蛋白晶体。从高等植物菠菜的叶片组织中提取得到了纯度较高也较完整的PSI色素蛋白复合物，可直接用于进行晶体的筛选。特别是，我们首次发现了Arf1在高尔基体膜上会形成双体，并且这一二聚体化调控膜运输过程中的囊泡的形成。同时我们还完成了一些膜转运相关蛋白的结构和功能的生物学研究。
6、江涛组
神经营养因子调控人体神经元细胞的生长、分化和凋亡，在神经系统的发育和维护中起着关键的作用。以往的研究表明，神经营养因子在老年痴呆、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈症和脑瘫等人类神经系统疾病的发生过程中起着关键的作用。 神经营养因子有两种不同的膜蛋白受体，分别为p75NTR 受体和酪氨酸激酶受体Trk。神经营养因子 与p75NTR 受体的作用方式并不清楚。最近,江涛课题组解析了利用晶体学方法解析了NT-3与p75NTR胞外区复合物的2.6埃分辨率的三维结构,并开展了相关的生化研究。 研究结果揭示了神经营养因子-3与p75NTR的特异性结合方式，使人们得以更加深入地了解神经营养因子与受体相互作用的机制，同时也为以神经营养因子为标靶的药物开发提供了重要的结构基础。 研究论文于2008年8月发表 于Nature杂志.
7、刘迎芳组
近年来，由H5N1亚型禽流感病毒所引起疫情的广泛传播对人类健康造成了全球性的重大威胁。目前仅有极少的专一性针对病毒表面蛋白的抗流感病毒药物可供使用，由于病毒的不断变异，开发新型抗流感药物已成为世界各国极为迫切的重大研究课题。禽流感病毒基因组含有8个负链病毒RNA片段，已知可以编码11种病毒蛋白质。其中，流感病毒RNA聚合酶由PB1，PB2和PA 等3个蛋白质亚基组成。在禽流感病毒的复制和感染过程中，流感病毒RNA聚合酶发挥了至关重要的作用，它负责病毒基因组vRNA的复制以及病毒mRNA转录等多方面功能。在禽流感病毒RNA聚合酶的三个蛋白亚基中，PB1和PB2蛋白功能比较清楚；而PA在该复合体中的功能一直没有明确。研究禽流感病毒RNA聚合酶的结构不仅对揭示它的作用机制具有重要的科学意义，而且还将为临床上抗病毒药物的研发提供清晰的分子模型。由于在对这一复合体的研究中存在着种种困难，因此该复合体或其组成亚基的结构一直没有得到揭示。
刘迎芳研究员领导的课题组和饶子和院士领导的南开大学/清华大学/生物物理研究所联合实验室在2008年合作完成了禽流感病毒 H5N1毒株RNA聚合酶复合体PA亚基的羧基端（PAC）与PB1氨基端短肽（PB1N）复合体的2.9?晶体结构（图1,2）的解析。该结构首次向人们清晰显示了PA与PB1多肽相互作用模式，发现该作用位点的氨基酸残基在流感病毒中具有高度保守性，为广谱抗流感(包括人流感和禽流感)药物研究提供了一个理想清晰的靶蛋白。同时，根据该复合体结构以及已知的一些蛋白突变体研究结果，推测了PA亚基在聚合酶中作用，为进一步的功能研究提供了分子基础。这一复合体结构的揭示，对揭示流感病毒聚合酶作用机制以及开展针对流感病毒药物设计工作都具有重大意义。该研究结果已发表在2008年8月28日的《Nature》杂志上。后续工作中，科研人员又进一步获得了该毒株聚合酶蛋白PA氨基端（注为PAN）的高分辨率晶体结构（2.2?），发现了以往人们不清楚的PA功能机制。目前，此项研究论文已被自然杂志（Nature）接收，近期内将获得发表。
8、刘志杰组
2008年课题组各项工作进展顺利，取得了一系列阶段性成果：
1、人才培养：课题组共有博士研究生5名，其中两名分别在英国和美国进行合作交流研究；硕士研究生5名；联合培养研究生3名（其中一名来自俄罗斯科学院生物物理研究所）。研究生广泛参与到各项科研工作中，博士研究生宋高洁和李杨分别在FASEB J和Proteins期刊上发表论文各一篇。博士后武栋也有一篇研究论文被FASEB J接收。
2、研究成果：在2008年共有8篇研究论文被SCI期刊发表或接收。一项与癌症治疗相关的研究成果“5.10-亚甲基四氢叶酸合成酶（MTHFS）的精细三维结构和相关应用”正在申报专利。
3、科研项目和基金：在继续实施科技部“863”、“973”、基金委和科学院研究项目的同时，课题组又获得新的基金资助。其中NSFC面上项目两项（主持一项、参与一项）；主持科学院“爱因斯坦讲习教授基金”、“重大装备项目”及“乌俄白国际合作研究”各一项；参与科技部“重大专项”和“973”项目各一项。
4、学术交流：积极参加了多个结构生物学方面的国际会议。接待多位海外科学家的到访。2008年5月主办了“国际X-射线晶体学讲习班”，我课题组博士研究生宋高洁在讲习班上获得“China Crystallography Future Star Rigaku Award”。
在新的一年中，课题组成员在院和研究所的政策方针指导下，将进一步加强自主创新能力和核心竞争力的建设，争取获得更多研究成果。
9、孙飞组
ERp44在早期分泌通路中，通过它的保守区域CRFS与底物形成二硫键而介导硫醇依赖性的滞留。分析ERp44蛋白的三维晶体结构，发现其C末端尾巴具有动态的构象，能够调节ERp44的分子伴侣活性和滞留内质网非正确折叠蛋白的功能。该课题与王志珍院士合作，成果发表在EMBO Reports(Wang et al., 2008)上.
研究了人类NK细胞颗粒酶M的晶体结构以及其与识别底物多肽的晶体结构，发现了颗粒酶M发挥蛋白酶活性更重要的氨基酸位点，设计了特异抑制颗粒酶M活性的化合物，对于颗粒酶家族生物功能的研究有重要意义。该课题与范祖森研究员合作，成果送审。.
猪动脉上皮细胞膜窖（Caveolae）的三维断层成像研究，发现上皮细胞膜窖并不是均匀的分布在细胞表面而倾向于聚集成簇。三维重构模型显示膜窖通过微管网络与某种细胞器相连，表明了膜窖内吞囊泡在细胞内的一种运输方式。作为我国首次电子断层三维成像技术的应用研究，该研究成果已经被《生物化学与生物物理进展》接收。
利用美国国家自动化分子电镜设施的硬件条件和Leginon软件系统，收集了生物大分子样品——二型分子伴侣的大量低温电镜单颗粒数据，成功获得了二型分子伴侣beta的8.4埃分辨率的三维重构图。
收集古菌分子伴侣beta蛋白晶体4埃分辨率的衍射数据，自身旋转函数表明beta组装体具有D9对称性，共有18个亚基组成；利用电镜三维重构模型对晶体学数据进行分子置换法求解相位，获得旋转平移函数解，相位扩展和非晶体学平均计算工作正在进行。
ACAP1是ADP核糖基化因子6（Arf6）的GTP酶激活蛋白（GAP），可分为BARPH和GAPANK两个重要的功能区域，BARPH现已收得一套分辨率为2.8埃的母体衍射数据，GAPANK收得分辨率为2.2埃的衍射数据，相应的突变体也得到较好的衍射数据（S554D获得2.2埃数据，S724D获得2.5埃数据），目前结构解析取得初步进展，Rwork已达22.6%，Rfree为26.5%，进一步的结构修正正在进行中。
LGT、LSP和LNT是脂蛋白成熟通路中的三种重要蛋白酶。通过建立体外的测活体系，验证了提纯的膜蛋白LGT具有生物学活性，能将前脂蛋白的信号肽特异位点进行磷脂酰修饰。由于LNT的底物需要LSP的修饰，在该测活体系中暂时未测到LNT的生物学活性，已经尝试构建其他的测活体系。收集了LGT的3.5埃衍射数据。
完成化合物Carboxin (CBN)，Oxantel pamoate (OTL)，Morantel citrate (MNL) ，Thiabendazole (TBZ)，Pentachloraphenol (PCP) 对线粒体呼吸链complex II活性的抑制实验，发现TBZ，CBN，PCP对complex II的醌还原活性具有很强的抑制能力，其中PCP具有最强的抑制活力。通过共结晶的方法，分别获得了complexII与CBN，TBZ和PCP的复合体晶体，并收集了衍射数据，分辨率为3.0埃，2.8埃，2.6埃。
启动线粒体beta氧化相关蛋白的结构及其在线粒体内部三维分布图谱的研究，目前克隆了6个相关基因，纯化出4个蛋白，获得2种晶体。
获得结核杆菌穿孔膜蛋白BrkA的晶体，目前优化已经能够衍射到4埃。
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